IPTG (изопропил-β-Д-тиогалактозид) - югары индуктив булмаган β-галактозида субстратының аналогы.IPTG индукциясе астында, индуктивлык кәтүге репрессор протеины белән комплекс барлыкка китерә ала, шулай итеп репрессор протеинының конформациясе үзгәрә, ул максатлы ген белән берләшә алмый, һәм максатлы ген эффектив рәвештә күрсәтелә.Шулай итеп, эксперимент вакытында IPTG концентрациясе ничек билгеле булырга тиеш?Зуррак яхшыракмы?
Башта, әйдәгез, IPTG индукция принцибын аңлыйк: Э.Колинин лактоза опероны (элементы) Z, Y, A өч структур генны үз эченә ала, алар тиешенчә β-галактозида, пермиз һәм ацетилтрансфераз кодлый.lacZ лактозаны глюкозага һәм галактозага, яки алло-лактозага кертә;lacY әйләнә-тирәдәге лактозаны күзәнәк мембранасы аша үткәрергә мөмкинлек бирә һәм күзәнәккә керә;lacA ацетил төркемен ацетил-КоАдан gal-галактозидка күчерә, бу токсик эффектны бетерүне үз эченә ала.Моннан тыш, O операция эзлеклелеге, башлангыч эзлеклелеге P һәм көйләүче ген бар. I ген коды - репрессор протеины, ул оператор эзлеклелегенең O позициясенә бәйләнә ала, оперон (мета) репрессияләнә һәм сүнгән.Катаболик ген активлаштыручы протеин-CAP бәйләү мәйданы бар, башлангыч эзлеклелектә агымдагы агымдагы P P эзлеклелеге, O эзлеклелеге һәм CAP бәйләү мәйданы бергәләп лак оперонының көйләү өлкәсен тәшкил итә.Өч ферментның кодлаштыру геннары бер үк көйләүче төбәк белән ген продуктларының координацияләнгән чагылышына ирешү өчен көйләнә.
Лактоза булмаганда, лак оперон (мета) репрессия хәлендә.Бу вакытта, PI промоутер эзлеклелеге контроле астында I эзлеклелеге белән күрсәтелгән лак репрессоры O эзлеклелегенә бәйләнә, бу РНК полимеразының P эзлеклелегенә бәйләнешен тыя һәм транскрипция инициативасын тыя;лактоза булганда, лак оперон (мета) индуктив булырга мөмкин Бу оперон (мета) системасында чын индуктивлык кәтүге лактоза түгел.Лактоза күзәнәккә керә һәм all-галактозида белән катализацияләнә, аллолактозага әверелә.Соңгысы, индуктивлык молекуласы буларак, репрессор протеины белән бәйләнә һәм протеин конформациясен үзгәртә, бу репрессор белокының O эзлеклелегеннән һәм транскрипциясеннән аерылуына китерә.Изопропилтиогалактозид (IPTG) аллолактоза кебек үк эффектка ия.Бу бик көчле индуктивлык кәтүге, ул бактерияләр белән метаболизацияләнми һәм бик тотрыклы, шуңа күрә ул лабораторияләрдә киң кулланыла.
IPTG оптималь концентрациясен ничек билгеләргә?Мисал итеп Э.Коли алыгыз.
E. coli BL21 уңай рекомбинант pGEX (CGRP / msCT) булган генетик инженер штаммы 50μg · mL-1 Amp булган LB сыеклыкка прививка ясалган, һәм төнлә 37 ° C температурада культуралы.Aboveгарыдагы культура 10 шешә 50мл яңа LB сыеклык прививкасына кертелде, 50μg · mL-1 Amp булган культураны киңәйтү өчен 1: 100 нисбәтендә, һәм OD600 бәясе 0,6 ~ 0.8 булганда, соңгы концентрациягә IPTG кушылды.Бу 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 ммол·Л-1.Шул ук температурада һәм шул ук вакытта индукциядән соң, аннан 1 мл бактерия эремәсе алынды, һәм бактерия күзәнәкләре центрифугация ярдәмендә җыелды һәм төрле IPTG концентрацияләренең протеин экспрессына тәэсирен анализлау өчен SDS-PAGE тәэсиренә китерелде. Иң зур протеин экспрессиясе белән IPTG концентрациясен сайлагыз.
Тикшеренүләрдән соң, IPTG концентрациясе мөмкин кадәр зур түгеллеге ачыкланачак.Чөнки IPTG бактерияләргә билгеле бер агулануга ия.Концентрациядән артып китү күзәнәкне дә үтерәчәк;һәм, гомумән алганда, күзәнәктә эри торган протеин яхшырак булыр дип өметләнәбез, ләкин күп очракта IPTG концентрациясе артык күп булганда, күп күләмдә кертү барлыкка киләчәк.Тән, ләкин эри торган аксым күләме кимеде.Шуңа күрә, иң уңайлы IPTG концентрациясе еш кына зуррак түгел, ә концентрация түбәнрәк.
Генетик инженер штаммнарын индукцияләү һәм үстерү максаты - максатлы протеинның уңышын арттыру һәм чыгымнарны киметү.Максатлы генның чагылышы штаммның үз факторларына һәм плазмид тәэсиренә генә түгел, индуктивлык кәтүгенең концентрациясе, индукция температурасы һәм индукция вакыты кебек башка тышкы шартларга да кагыла.Шуңа күрә, гомумән алганда, билгесез протеин белдерелгән һәм чистартылганчы, тиешле шартларны сайлау һәм иң яхшы эксперименталь нәтиҗәләр алу өчен индукция вакытын, температураны һәм IPTG концентрациясен өйрәнү яхшырак.
Пост вакыты: 31-2021 декабрь